ПЕПТИД ЭПИТАЛОН ИНДУЦИРУЕТ ТЕЛОМЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ И ЭЛОНГАЦИЮ ТЕЛОМЕР В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

(13-05-2010 20:27) 

Пептид эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) сконструи­рован и синreзирован на основе анализа амино­кислотного состава
комnлекеноrо пептидного препарата эпиталамина, вьщеленноro из эпифиза мозга ЖИВОТНblХ [10]. Установлено, что эпита­лон восстанавливает нарушенную нейроэндок­ринную регуляцию у старых обезьян [11], ин­ дуцирует активацию рибосомальных генов [1].


Также обнаружено, что добавление тетрапепrида в культуру лимфоцитов, выделенных от людей пожилого и старческого возраста, способствует деконденсации перицентрометрического гетеро­ хроматина и активации генов, репрессированных
вследствие зависимой от возраста конденсации эухроматиновых регионов хромосом [3]. Эпита­ лон способствует  увеличению средней продол­жительности жизни у мышей и крыс и снижает частоту хромосомных аберраций у ускоренно
стареющих мышей SAМ [2,4]. Следует отмenrrь, что эпиталон увеличивает среднюю и макси­мaльнyю продолжительность жизни без разви­тия злокачественных новообразований у этих животных [4-6].

Теломеразная теория старения связывает возрастное снижение пролифератив­ ного потенциала тканей с критическим укоро­ чением теломер в процессе клеточного деления [15]. Теломераза представляет собой рибонуклеи­новый фермент, достраивающий потерянные из­ за асимметрии в синтезе лидирующей и отстаю­ щей цепей днк теломерные повторы ПАGGG
[13J, и кодируется двумя генами - для РНК-компонента и белкового компонента фермента [9]. у человека экспрессия белкового компонен­та теломеразы и соответствующая ферментатив­ная активность наблюдается в большинстве злокачественных, половых, ранних эмбриональных и, возможно, стволовых клетках. Сомаrnческие клетки человека теломеразной активности лише­ ны [12]. В настоящей работе было исследовано влияние эпиталона на экспрессию
каталитичес­кой субъединицы теломеразы, активность тело­меразы и удлинение теломер в соматических клетках человека.


МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ


Культура положительной по теломеразе клеточ­ ной линии HeLa [9] и первичн:ая культура че­ловеческих фетальных легочных фибробластов 602/17 (24 нед) бьша получена из лаборатории клеточных культур НИИ гриппа РАМН. Клет­ки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина, 100 МКГ/МЛ гентаМИ­цина сульфата. Фетальные фибробласты, начи­ная с 27-го пассажа, обрабатывали эпиталоном
в концентрации 0.05 МКГ/МЛ в течение 4 cyr и анализировали [3].

Для детекции экспрессии белковой ката­литической субъединицы теломеразы феталь­ные фибробласты помещали на стерильные пред­метные стекла ("Menzel-Glaser"). Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли мы­шиными моноклональными антителами к ка­талитической субъединице человеческой тело­меразы NCL-hТЕRТ ("Novocastra Laboratories Ltd. "). В качестве вторичных антител исполь­зовали универсальный пероксиnaзный набор АВС ("Dako").

Окрашивание препаратов проводили в соответствии с инструкциями к наборам указан­ных реактивов. Микроскопию осуществляли на аппарате "Nikon Eclipse Е400" с цифровой ка­мерой "AST1".

Энзимаmческую активноCTh теломеразы оп­ределяли по протоколу амплификации теломер­ных повторов (TRAP) [9]. 106 Клеток отмывали холодным забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР) и лизировали 100 мкл холодного СНАРS-буфера, в котором в 10% гли­церине содержалось 10 мМ трис-НСI, рН 7.5,1 мМ MgCl" 1 мМ ЭПА, 0.5% CHAPS, 0.1 мМФМСФ, 5 мМ 2-меркanтоэтанола, на льду в те­чение 30 мин. Экстракты центрифyrnpовали при 12 000 об/мин в течение 30 мин при 40с. Су­пернатанты переносили в пробирки и хранили при -700с. для анализа теломеразной активности
in vitro 2 мкл супернатанта добамяли к 46 мкл однократного Таq-буфера, содержащего 2 мкМ ТS-праймера (5'-ААТ CCG TCGAGC AGA GП­3'), 50 мкМ dNTPs и инкубировали при 300С в течение 30 мин. Затем добавляли 2 мкМ сх­
праймера (5'-ССС ПА ССС ПА ССС ПА СССПА -3'), 5 вц Тaq-ДНК полимеразы ("Promega") и проводили 35 циклов ПЦР с параметрами; 94"С - 1 мин, 50"С - 1 мин, 720С - 1.5 мин на термоциклере с нагревающейся крышкой "DNA Engine РТС-200" ("М] Research"). Продукты пцр электрофоретически разделяли в 10% не­ денатурирующем полиакриламидном геле, окрашивали с помощью "SYВR Осееп" ("Molecular Probes") и визуализировали в ультрафиолето­ ВОМ свете.

Среднюю длину теломер в индивидуальных клетках измеряли методом флкюресцентной гиб­ридизации in situ с проточной цитофлюоримет­рией (flow-FISH) [14]. для этого клетки дваж­ды отмывали в ЗФР, содержащем 0.2% БСА, и ресуспендировали в растворе для гибридизации, содержащем 70% формамида, 1.0% БСА, 20 мМ трис-НС1 рН 7.0 ("Sigma") и 0.3 мкг/мл специ­
фичной для теломер СзТ~ пептидно-нуклеиновой кислотной (ПНК) пробы, меченной ФИТЦ ("PerSeptive Biosystems"),  Образцы подвергали тепловой денатурации при 80"С в течение 10 мин с последующей гибридизацией при комнат­ной температуре в темноте в течение 2 ч. За­тем суспензию клеток цеmpифугировали, сynер­натанты удаляли, а клетки дважды отмывали в буферном растворе, содержащем 70% формами­да, 10 мМ трис-НС1 рН 7.0, 0.1% БСА, 0.1% твин-20 ("Sigma"), и один раз в ЗФР, содержа­щем 0.1% БСА, 0.1% твин-20. После отмывания клетки ресуспещировали в зфр, содержащем
0.1% БСА, 10 мкr/мл РНКазы А ("Sigma"), 0.06 мкг/мл йодида пропидия ("Sigma") и инкубиро­ вали при комнатной температуре в темноте в те­чение 2 ч. Контрольную rnбридизацию без ПНК осуществляли для выявления фоновой авто­
флюоресuенции и для расчета спеuифичной для теломер флюоресценции в условных единицах.
104 Клеток анализировали методом проточной цитофлюориметрии на приборе "FACSCAN" ("Beckton-Dickenson").

Стаmстическую обработку данных осуществ­ляли с помощью программного обеспечения "Cel1Quest" и ":XnViewl.l7". Достоверность раза Рис. 1. КЛетки НеLз (а) и фетальные фи6робласты. обработанныеэпиталоном (6). Окраска иммуноперокси­ дазным методом, х400. И оценивали с ПОМОЩЬЮ I критерия Стьюдеtrra.
 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


И.,муногистохимичес.кое иСCJ1едование показало И1пенсивное ядерное окрашивание клеток поло­жителъной по теломеразе линии НеLз (рис. 1, а), использованных в качестве ПОЛOЖlпельноro кокг­ром, а также обработанных ЭШlталонам фeтaIIь­кых фибpo(inастов (рис. 1, 6). В ИНIЗJCfНЫХ (КОJП­рольных) феталЬНЫХ фибробластах подобного
окрашивания не обнаружено.


Винтактных феталъных фибробластах также не обнаружено теломеразной активности, в РНС. 2. Электрофоретическоеразделение и детек­ЦИR в пддг ПЦР-8мплиФицированных удлиненных TS-праЙмеров. 1- 10 П.О., ДНК-маркер; 2- клет­1(10'1 НеLз; 3 - фибробласты; 4 - фибробласты, об­работанные эпиталОНО'-4. то времв как такая активность выявлена в клет­ках HeLa и фибробластах,обработанныx эпиталаном (рис. 2).

Фякюресuентная гибридизarrnя in situ с про­точной шпофлюориметриеR продемонстрирова­ла увеличение средней и максимальной длины те­JIOMep в фазе G1 клетоЧНОro uикла в фетальнbIX фибробластах, обработан.н.ых эnитaлоном, rю qшJ­нению с КОНТРОЛЬНЫМИ клеткзМJ1 (рис. 3). Средняя мина теломер в фазе G I клеточного цикла в кокrpoле составила 180 усл. ед. Добавление эпиталона привело k увеличению средней длины теломер до 240 усл. ед. (р<0.О5).

Результаты проведенного эксперимента по­казали, что эпиталон в соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзи­матическоro компоненга теломеразы, теломepaз­ную активность и удлинение теломер (омоложение организма).


KOlOpoe в среднем составило 33.3%. Таким образо.., 8 нашем эксперименте впервые установлена ин­
дукция теломеразной аlCТИВНОСТИ пептидом. Эти данные в значительной мере способствуют по­ ниманию геропротекторных эффектов эпитало­на в различных экспериментальных моделях [10].


Известно. 'fГO кркrически короткие теломеры не способны предотвращать слияние хромосом, 'ПОможет привести
к активации протоонкогенов и малигнизации клетки [7], активация теломера­ зы и удлинение теломер под действием пепти­
да объясняет один из механизмов противоопу­ холевого действия эпиталона у старых ЖИВOПIЫX.

Источник в формате PDF


ЛИТЕРАТУРА
1. Mиcuмoв с.В., Бохелер к.п., Хавинсон в.х., Аниси­
мов В.n. // Бюл. экспер. биал. 2002. Т. 133, :N2 3.
с. 340-347.
2. Розенфмьд с.в., Того Е.Ф., Михеев В.С. и др. //Там
.же. С. 320-322.
695
3. Ха8инсон В.Х, Лежава Т-А., Монаселuдзе Дж.г. и др.
// Там же. N! 10. С. 451-455.
4. Anisiтov УМ, Кhavin.ron yКh., MikhahkiAl, YasЫnA.I.
// МесЬ. Лging Dev. 2001. Vol. 122. Р.41-68.
5. Anisimov v.N., Khavinson V.Kh., Popovich 1.G.,
Zabez/linski М.А. // Cancer Lett. 2002. Уа!. 183. Р. 1-8.
6. .AnШmov УНО, Кhavinson V.Кh., Provinciali М. е! 0/. //
Int. J. Cancer. 2002. Уа!. 101. Р. 7-10.
7. EJmоге L. W, Но/!S.E. // Моl. Carcinog. 2000. УО!. 28,
N 1. Р. 1-4.
8. Реng J., Funk WD., Wang S.S. е! 0/. // Science. 1995.
Val. 269, N 5228. Р. 1236-1241.
9. Нiyama Е., Нiyama к., Yokoyama Т. etal. //Nat.Med.
1995. Уа!. !. Р. 249-255.
10. Юuwinsоn V.Кh.//Neuraendacrino!. Lett. 2002. Уоl. 23,
Supp!. 3. Р. 11-144.
11. Кhavinson v., (ioncharova Но, Lapin В.// Ibid. 2001.
Уаl. 22. Р. 251-254.
12. Meyer.s'on м., Counter с., Баtоn E.N. // СеН. 1997.
Уаl. 90, N 4. Р. 785-795.
13. Moгin G.B. // Cell. 1989. Vol. 59. N 3. Р. 521-529.
14. Rufer Но, Dragowska W, ТhоmЬшу G. е! al. // Nat.
Biotechnal. 1998. Уаl. 16, N 8. Р. 743-747.
15. Wright W.E., Shay J. W // Nat. Вiotechnol. 2002.
уо]. 20, N 7. Р. 682-688.